Zytologische Aspekte und unterschiedliche Reaktionen von Melatonin bei von
durch Melanophore bewirkte Farb-Mutationen beim Guppy
Poecilia reticulata
P.L. Nayudu und C.R. Hunter

Beim Guppy (Poecila reticulata) findet man bei der Wild-Form vier Arten von Melanophoren.
Jede der untersuchten X-Chromosomen gebundenen phänotypische Variante – Nigrocaudatus II, pigmentierte Caudale und Flavus (gelbe Flossenfarbe; franzpeter) – ist aus vom Wild-Typ unterschiedlichen Melanophoren zusammengesetzt und unterscheidet sich durch verschiedene entwicklungsbedingte und morphologische Charakteristiken.
Pigmentierte Caudale ist unter den Dreien einzigartig, da sie aus zwei verschiedenen Melanophoren-Typen besteht. Die Populationsdynamiken jedes Melanophoren-Typs werden beherrscht durch den Wettstreit um die Entwicklungsvoraussetzungen der Melanophoren unter verschiedenen genetischen Kontrollen, welche zur gleichen Zeit bestehen.
Wildform und zwei Muster Ni II und Cp sind hinsichtlich ihrer Melatonin-Zusammensetzung
getestet worden.
Schwanz und Körpermuster erwiesen sich unterschiedlich in der Art, wie sie die Fische veranlaßten, ihre normale Nacht-Färbung anzunehmen.
Bei den meisten Wirbeltieren sind Melanophoren weit verzweigte Zellen, die bestimmte Organellen , sogenannte Melanosomen, enthalten, in denen Melanin gelagert wird. Aufgrund dieser Pigmentation sind die Melanophoren unter dem Mikroskop ohne Färbung sichtbar.
Ebenso haben die Melanophoren bei allen Wirbeltieren eine allgemein ähnliche Erscheinungsform; es gibt jedoch Unterschiede in der Größe, Länge und Dicke der Dendrite, in ihrer Lage und Form. Derartige genetisch festgelegte morphologische Unterschiede von Melanophoren-Beständen von Fischen wurden mit photographischen Illustrationen auch für den Platy Xiphophorus maculatus (Gordon, 1959) und für die Gambuse Gambusia affinis
(Regan, 1961) berichtet.
Obwohl der Guppy, sowohl die Wildform (Haskins et al., 1961) als auch die domestizierten Populationen (Dzwillo, 1959), gut bekannt ist für seine extreme Variation in den Farbmustern, wurde über die Cytomorphologie der Farbmuster wenig berichtet (Goodrich et al., 1944).
Hier werden die die drei genetisch bekannten domestizierten melanischen Muster (Nayudu, 1979) enthaltenden Melanophoren beschrieben und mit den ungemusterten Melanophoren in der Wildform verglichen.
Zusammenziehen oder Ausdehnen der Melanosomen (melaninenthaltende Granule), in den Melanophoren (schwarz-pigmentierte Hautzellen niederer Wirbeltiere), kann durch Einwirkung von Hormonen bewirkt werden, (Waring, 1963), oder durch nervliche Kontrolle, (Neill, 1940). Melatonin, ein Hormon der Epiphysis (Lerner et al., 1958; Kappers, 1971), soll das melanosome Zusammenziehen bei niederen Tieren bewirken (Waring, 1963; Bagnara, 1965), Jedoch wurde bereits von Reed (1968) und Reed et al. (1969) berichtet, dass vier Arten des Fisches Nannostomus durch Annahme der Nachtfärbung reagieren. Um dies zu erreichen ziehen sich bestimmte Gruppen von Körper-Melanophoren unter der Einwirkung von Melatonin zusammen, während andere ihre Pigmentation ausdehnen. Bei anderen getesteten Species antworteten alle Melanophoren des Körpers einheitlich mit Ausdehnung, Zusammenziehen oder gar nicht.
Der Guppy ist eine Species, bei der eine vergleichbare Reaktion wie beim Nannostomus
erfolgt. Es wurden hier zwei bekannte genetische Mutanten zugrunde gelegt, um eine erste Untersuchung über die genetische Kontrolle bezüglich der Reaktion der Melanophoren auf Melatonin durchzuführen.


Material und Methoden
Individuen der Arten Poecilia reticulata , Guppy, der Wildform und den folgenden X-gebundenen mutierten Mustern (Yamamoto, 1975), wurden der Analyse zugrunde gelegt.
Die detaillierte Herkunft eines jeden Musters ist von Nayudu (1979) geprüft worden.
Schwanz-Muster Flavus (Fla)
Pigmentierte Caudalis (Cp)
Körper-Muster Nigrocaudatus II (NiII)
Die Fische wurden mit 0,02% Sandoz MS222 anästhetisiert. Unter dem Einfluss der Anästhesie dehnten sich die Melanophoren voll aus. Unvergrößerte Ansichten der Phänotypen wurden mit einer 35 mm Kamera mit Makro-Linse die an einer Kopiervorrichtung befestigt war, aufgenommen. Die Melanophoren wurden unter einem Ausschnitts-Mikroskop aufgenommen, wobei ein Leitz Mikroskop mit Leitz Orthomat benutzt wurde. Die befestigten Schwanzflossen wurden mit Silberhexamin (Drury et al., 1967) gefärbt, wodurch die unpigmentierten Melanocyten, die Prälmelanin enthielten, dunkel gefärbt wurden.
Einige Fische wurden mit Säugetier-Melatonin (N-Acretyl-5-Methoxy tryptamine; Sigma, St. Lois, U.S.A.) behandelt. 1 ml einer Lösung von 1mg/ml wurde mit 250 ml Wasserbehälter in einen Becher geschüttet, jedoch war die Konzentration nicht kritisch. Der Fisch, der sofort vor und nach der Behandlung in einer Kuvette photographiert wurde, wurde 10 Minuten lang in dem Becher belassen.
Ergebnis
Melanophoren der Wildform sind gewöhnlich im Guppy vorhanden. Andere, variable Muster erzeugende, sogenannte mutante Melanophoren, können überlagert sein.
Zytologie und Musterentwicklung
Melaophoren der Wildform-Schwanzflosse, sichtbar eine Woche vor der Geburt, sind immer
verbunden mit den Flossenstrahlen und sehr oft befinden sie sich zwischen den beiden Hälften des Strahls. Dazu kommt noch, dass es schwierig ist ihre Größe exakt zu messen, da ihre größte Oberfläche äußerlich nicht untersucht werden kann, der Durchmesser im Fisch ist schätzungsweise 10 bis 20 µm eine Woche vor der Geburt, und wachsen sie bis zu 50 und 60 µm im zwei Monate alten Fisch.
Der Schwanzstiel trägt Wildform-Melanophoren von drei verschiedenen Typen: Große Melanophoren rückwärts, bauchwärts und seitlich der Wirbelsäule; corollar (Korollar: Ableitung; corollar: abgeleitet, ps ) formen die Melanophoren in der Haut das charakteristische verästelte Muster, woraus der Name Poecilia reticulata herrührt; und baumähnliche Melanophoren in der die Schuppen bedeckenden Haut.
Eine Woche vor der Geburt sind beim Fisch nur die großen rückwärtigen, bauchwärtigen und seitlichen Melanophoren pigmentiert. Dies kann man auch 3 Wochen nach der Geburt sehen. Von der 5. Woche sind die Dendrite so dick geformt, dass sie aussehen, als ob sie zu dicken Ästen verschmolzen wären, von denen aus dünnere Dendrite ausgehen. Beim ausgewachsenen Fisch beträgt der Durchmesser durchschnittlich 200 µm, etwa zweimal die Größe der corollaren Melanophoren, und sind auch dichter pigmentiert. Zwei oder drei Wochen nach der Geburt erscheinen einige wenige präcorollare Melanophoren (schätzungsweise 50 µm im Durchmesser) und sie befinden sich dort, wo sich das Diamant-Muster bilden wird. Allmählich in den nächsten 4 Wochen nehmen die Zellen ihre corollare Form an. Der Wechsel von der dendriten zur corollaren Form ist das Ergebnis der Weiterentwicklung der zellularen Projektion. Der Zellkörper der corollaren Melanophoren ist ungefähr 9 µm breit und die totale Länge beträgt 50 bis 100 µm.
Im Alter von 3 Wochen bis zu einem Monat erscheinen die Dendrit-Malanophoren in den Schuppen. Diese Melanophoren sind halb so groß wie die corollaren Zellen, obwohl der Zellkörper in beiden Fällen ziemlich gleich ist.
Die mutierten Melanophoren in der vorliegenden Studie sind diejenigen, die unter der Kontrolle eines der Supergen-Komplexe erscheinen, wie sie sich in domestizierten Populationen zeigen (Yamamoto, 1975). Sie haben leicht zu unterscheidende entwicklungsmäßige und morphologische Charakteristiken. Melanophoren des gelbes Schwanzmusters (Fla) liegen in der Form zwischen den dendritischen und corollaren Zellen, und sie erscheinen an charakteristischen Stellen auf der Schwanzflosse.Ihre Gesamtgröße variiert zwischen 30x30 µm bis zu 50x70 µm. Die erste Pigmentation erscheint zwei Wochen nach der Geburt und besteht charakteristischerweise aus einem Triangelflecken von Melanophoren in der vorderen rückwärtigen Ecke der Schwanzflosse, wo sie sich mit dem Schwanzstiel verbindet, und ein Streifen Melanophoren entlang der Bauchecke der Flosse.
Die Melanophoren dehnen sich aus, während sie sich vervielfältigen, und das Ergebnis, das Erwachsenen-Muster (ausgeprägter bei den Männchen als bei den Weibchen), umfaßt eine beträchtliche individuelle Variabilität im Aussehen, obwohl noch immer erkennbar.
Pigmentierte Schwanzmuster (Cp) bestehen aus zwei morphologisch unterscheidbaren Populationen von Melanophoren. Das eine vom corollaren Typ 90x90 µm liegt entlang des Schwanzstielflossenzusammenschlusses und bilden den zentralen Streifen des Erwachsenen-Musters. Die andere, doppelpolig 80x20 µm, bedeckt den rückwärtigen und bauchwärtigen Bereich der Flosse. Die Melanophoren sind im Alter von 3 Wochen in charakteristischem Muster erkennbar, sie erinnern an typische Wildform-Melanophoren. Bei den ausgewachsenen Männchen prägen sie sich mehr aus, als bei den Weibchen. Es zeigen sich zwei extreme Beispiele eines phänotypischen Kontinuums, in der die kritische Differenz darin besteht, ob das Wachsen der Schwanzflosse vor oder nachdem die Cp-Ecken-Melanophoren sich um das hintere Teil der Schwanzflosse ausgebreitet haben. Die letztere Alternative beendet effektiv das Muster und verhindert die Ausbreitung der Melanophoren des zentralen Streifens.
Trotzdem der vereinte Phänotyp von Fla und Cp eine größere Variabilität des erwachsenen Erscheinungsbild zeigt, ist das erste Aussehen einheitlich und junge Fische mit beiden Genen können sicher bestimmt werden. Die Fla-Cp Jungen unterscheiden sich von den Nur-Cp durch ein dunkleres Schwanzmuster, und anfangs unterscheiden sie sich von Fla durch die rückwärtige Triangel, hervorgerufen durch die Kombination von Cp und Fla Melanophoren.
Es hat sich gezeigt, dass die Ausgangsmenge wichtig ist bei der Entscheidung, welches der beiden Phänotypen im erwachsenen Tier (Nayudu, 1979) vorherrscht. Zum Beispiel würde ein Individuum mit 2 Fla Genen und 1 Cp Gen eher dem Fla- als dem Cp-Typ ähneln.
Nigrocaudatus II (Ni II), das einzige mutierte Körpermuster, welches in dieser Studie beschrieben wird, ist insofern einzigartig, als es sich schon bei der Geburt zeigt. Die Melanophoren, aus denen es besteht, sind relativ groß, 90 – 100 µm bei der Geburt, und sich bis zu 200 µm Länge anwachsend bei erwachsenen Tieren; und sie sind im Erscheinungsbild ähnlich den Melanophoren, die im Schwanzstamm, an der rück- und bauchwärtigen Spitze, der Wildform zu sehen sind.
Zur Zeit der frühen Entwicklung des Ni II- Musters breiten sich die rückwärtigen, bauchwärtigen und seitlichen Wirbelsäulen-Melanophoren von ihren ursprünglichen Positionen aus und überdecken die Diamantmuster-Melanophoren. Die großen Melanophoren
breiten sich weiter aus und bedecken die Haut des Schwanzstiels in allen Schichten (Nayudu und Hunter, 1978). In diesem Stadium können noch keine individuellen Melanophoren unterschieden werden. Hinzu kommt eine weitere Dunkelung bei den Männchen mit Beginn der sexuellen Reife.
Gleichverlaufend mit der Entwicklung von Ni II am Schwanzstiel breiten sich die Melanophoren zur nähesten Position der Schwanzflosse hin aus und erzeugen eine allgemeine Dunkelung des charakteristischen Erscheinungsbildes. Bei erwachsenen Männchen erscheint das schwarze Gebiet scharf abgegrenzt, bei den Weibchen hingegen bleibt es für ein Jahr oder länger unscharf.
In Anwesenheit von Ni II erzeugt das von Cp und Fla kontrollierte Schwanzflossenmuster
eine variabel ausgedehnte Form in geänderter Gestalt von der Mitte der Schwanzflosse her.

Diese Gegend der Schwanzflosse (die vorige, rückwärtige und bauchwärtige Spitzen), welche immer Schwanzmuster ohne Ni II aufweist, sind unpigmentiert, wenn sie sich mit Ni II zeigen. Silber-Hexamin-Farbe zeigt keine Melanophoren in diesen Gebieten.
Reaktion auf Melatonin
Die von mutierten Melanophoren herrührenden Muster sind auch unterscheidbar aufgrund ihrer andersartigen phisiologischen Reaktion auf Melatin. Ein Fisch vor der Behandlung zeigt die normale Tagfärbung. Nach der Behandlung zeigt er die Nachtfärbung.
Erörterung
Beim Studium der melanischen Mutations-Muster des Guppy erkennt man acht Typen von Melanophoren, die sich, in Größe, Gestalt, Position und Entwicklungs-Schema, spezifisch für jedes Muster unterscheiden. Dies ist bei weitem das komplexeste Bild genetischer Kontrolle von Melanophore, über das je berichtet wurde. Der einzige vorausgegangene Bericht über Melanophor-Unterschiede beim Guppy stammt von Goodrich et al., (1944), der die reduzierende Wirkung der genetischen Variante „Gold“ und „Blond“ der Körper- und Schuppen-Melanophoren untersuchte.
Bei der Wildform des Guppy gibt es drei Melanophoren-Formen am Schwanzstiel und eine Form auf den Flossen. Die zwei zuvor von Goodrich et al. (1944) angeführten Schwanzstiel-Melanophoren, das dendrite Schuppen- und das corollare Diamant-Muster, sind in der Haut vorhanden (Nayudu und Hunter, 1978) und formen ein besonderes Muster am Schwanzstiel. Die Flossen haben kleine Melanophoren, die eng mit Strahlen verbunden sind. Über diese, und einen dritten Schwanzstiel-Typus, der parallel zur Wirbelsäule verläuft, rückwärtig, bauchwärtig und seitlich, wurde bisher noch nicht berichtet. Die mit der Wirbelsäule verbundenen Melanophoren sind beim Guppy groß in Vergleich zu den anderen, und sind vergleichbar in der Größenordnung mit dem Moskitofisch Macromelanophores (Regan, 1961), haben jedoch nur etwa ein Drittel der Größe des Platy Macromelanophores, welche schätzungsweise eine Länge von 500 µm besitzen (Gordon, 1959).
Wenn Ni II vorliegt, erkennt man zuerst die Ausdehnung der Wirbelsäulen-Melanophoren
mit nachfolgender Vermehrung der vergrößerten Melanophoren am Schwanzstiel, in allen Hautschichten (Nayudu und Hunter, 1978), und in der Schwanzflosse. Während dieses Prozesses sind die corollaren und dendritischen Zellen der Wildform weniger sichtbar, und die Cp- und Fla-Melanophoren werden an der Entwicklung gehindert, bis die Ni II-Melanophoren ihre Erweiterung beendet haben. Die Minderung des Aussehens in dden Wildformzellen und die Hinderung der Pigmentation der näheren rückwärtigen und bauchwärtigen Ecken der Schwanzflosse, wäre ein Beispiel interzellularer Regulation.
Niu (1959) bemerkt, dass dies in jeder Entwicklungssituation geschehen könne, in der sich ein Zelltypus schneller als ein anderer ausbildet. Da die Ni II Zellen von Geburt an vorhanden sind und sich schnell vermehren, haben sie einen Vorteil gegenüber den Schwanzflossenmustern, die sich erst einige Wochen nach der Geburt zu entwickeln beginnen. Wenn die Ni II Zellen ihre Verbreitung beenden, sind die Schwanzflossenmuster in der Lage, sich in den einzig verfügbaren Raum, in die entfernter gelegenen Positionen der Schwanzflosse zu entwickeln.
Die näher gelegenen rückwärtigen und bauchwärtigen Ecken der Schwanzflosse, die normal mit Fla und Cp pigmentiert sind, werden nicht durch Schwanzflossen- oder Ni II-Melanophoren pigmentiert. Die Melanophoren, die die beiden Schwanzmuster beinhalten, sind von geringerer Größe als die Wibelsäulen- und Ni II-Melanophoren, unterscheiden sich jedoch noch in anderen Merkmalen voneinander. Fla-Melanophoren sind morphologisch und vorkommensmäßig unterschieden von den Wildform-Schwanzflossen-Melanophoren und stellen einen besonderen Zelltypus dar. Das erste Auftreten der Muster ist invariabel und charakteristisch. Die Ausbildung und quantitative Variation der untersuchten drei Muster weisen die geringsten Schwierigkeiten auf.
Natürlich zeigt sich eine große Vielfalt phänotypischer Entwicklung, wenn sich Fla und Cp auf der gleichen Flosse entwickeln, vergleichbar des Genanzahl-Effekts (Nayudu, 1979) ,
und der wetteifernden Entwicklung zweier Muster wie Ni II und Schwanzflossenmuster, das oben erörtert wurde, obschon der Wettstreit hier ausgeglichener abläuft.
In seinem ersten Entwicklungsstadium ähnelt das Cp Schwanzmuster einer bestimmten Art der Wildform-Melanophoren an der Schwanzstielflossenbeuge und den rückwärtigen und bauchwärtigen Ecken der Schwanzflosse. Die Anwesenheit von zwei verschiedenen Zelltypen, den kleineren Flossenecken-Melanophoren und den größeren corollaren Schwanzstiel-Melanophoren, beweist, dass hier zwei eng gekoppelte Gene die Melanophoren des Cp-Musters kontrollieren. Keines von beiden (Vorkommen, ps) wurde unabhängig vom anderen beobachtet (Nayudu, 1979).
Die unabhängige Variation der zwei Muster während der späteren Entwicklung führte indirekt zu der zwei-Gene-Theorie. Dies ist der erste Bericht eines melanischen Fischmusters, welches aus zwei morphologisch verschiedenen Zellpopulationen besteht.
Der Guppy wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um einen täglich zirkadianen Wechsel im Aussehen der schwarzen Hautmuster, der unterschiedliche Zusammenziehung und Ausdehnung von Pigment-Granulen zugrunde liegen, vergleichbar in gewisser Weise der Veränderung wie bei dem Nannostomus (Reed, 1968; Reed et al., 1969) gezeigt wurde.
Bei beiden Arten kann gezeigt werden, dass der Wechsel der nachts eintritt, der Kontrolle von Melanin unterliegt. Diese Beobachtung erhöht indirekt die Bedeutung der zirkadianen Sekretion von Melatonin durch die Epyphyse vonKnochenfischen (Kappers, 1971).
Beim Guppy, dessen die Körpermuster verbinenden Melanophoren hier untersucht werden,
vereinigen die Wildform und Ni II ihre Pigmentgranulenin Reaktion auf Melatonin.
Die hier vorgeführten Untersuchungen haben gezeigt, dass sich Ni II-Melanophoren, während der Entwicklung der Muster, zu den Flossen ausdehnen. Diese Zellen sind beide identifizierbar als Entwicklungsmuster und sie sind morphologisch den Ni II Melanophoren gleich, auch reagieren sie entsprechend wie Ni II-Melanophoren und verbleiben am Körper.
Melatonin führt zur Verteilung von Melanosomen in den durch Cp-Genen kontrollierten Schwanzflossenmustern. Diese Verteilung taucht auch bei den Cp-kontrollierten Melanophoren am Schwanzstiel auf, welche während der Musterentwicklung und Zellmorphologie aufgezeigt wurden.
Die Resultate verschiedener Reaktionen auf Melatonin bei genetisch unterschiedlichen Melanophoren zeigen klar, dass die Reaktion derMelanophore auf Melatonin genetisch kontrolliert wird. Dies ist der einzige Bericht über genetisch identifizierte Melanophoren, die unterschiedlich auf Melatonin reagieren. Beim Nannostomus wird über keine innerspezifische Muster-Variabilität oder über ein Gen-Wissen der Muster berichtet.
Bikle et al. (1966) schlug vor, dass die Beweglichkeit der Melanosome auf Mikrotubule beruhte. Experimente, die antimikrotubule Faktoren benutzten, haben seitdem deren Rolle in der Bewegung von Melanosomen nachgewiesen (Wikswo und Novales, 1969, 1972; Schliwa, 1975).
Bei Fischen und Amphibien ist der Mechanismus, den der Einfluss von Mikrotubulen die Bewegung der Melanosome beeinflußt, noch immer unklar, er ist jedoch in gewisser Weise verwandt dem Zusammenziehungs- Behinderungs-Effekt bei c-AMP (Novales und Fujii, 1970), und die Aufmerksamkeit scheint anzusteigen, wie durch MSH gezeigt wird, ein Hormon, welches die Ausdehnung von Melanophore verursacht (Abe et al., 1972). Cytochalisin B, ein Agens, das Mikrofilamente trennt, verursacht eine Zusammenballung von Granulen trotz der Anwesenheit von MSH (McGuire et al., 1972), und bestätigt damit ihre intakte Struktur. Beim Frosch wird eine umfassende Zusammenziehung von Melanophor-Granulen durch Melatonin eingeleitet, um, wie sich herausgestellt hat, das Anwachsen von c-AMP, hervorgerufen durch MSH, zu verhindern, jedoch nicht den künstlich hervorgerufenen c-AMP Effekt. Solche Ergebnisse lassen vermuten, dass der Hinderungseffekt im Adenyl-Cyclase-System zu suchen ist (Abe et al., 1972).
Eine Spezies wie der Guppy, der Melanophore besitzt, die auf gegenüber Melatonin in zwei Arten reagieren, stellen ein Rätsel dar.
Nichtsdestoweniger mag es möglich sein, die beiden Melanophor-Typen auf Unterschiede in der Reaktion sowohl ihrer Ultrastruktur als auch ihrer Biochemie auf Melatonin hin zu analysieren, und hierzu die Mutationen als Mittel zu Nutzen, Einsicht in den Grundmechanismus ihrer Funktion zu erlangen, was schwieriger mit gleichbleibenden Zellen wäre.

1979 by the American Sciety of Ichthyologists and Herpetologists